Annexe C : Méthodes d'analyse de la Legionella

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Le personnel doit prendre toutes les précautions nécessaires relativement à la santé et la sécurité, y compris l'utilisation d'équipement de protection individuelle (EPI), lors de la prise d'échantillons pour l'analyse bactérienne. Consulter le document de l'Occupational Safety and Health Administration (OSHA) Technical Manual, Section III, Capter VII – Legionaire's Disease pour des directives sur l'EPI nécessaire.

Un programme d'analyse de la Legionella ne devrait pas remplacer pratiques éprouvées du génie. Très souvent, les résultats des analyses indiquant l'absence de Legionella donnent un faux sentiment de sécurité. Les résultats d'analyse ne sont valides que pour une zone et une période données et les conditions des systèmes, comme les tours de refroidissement, peuvent varier considérablement et rapidement. Les systèmes qui ne font pas l'objet de procédures d'inspection et de nettoyage strictes ou qui ne sont pas dotés d'un système de traitement de l'eau sont toujours à risque.

Il n'y a pas de corrélation simple entre la présence de l'organisme dans l'eau et le risque d'infection. La bactérie est souvent présente dans les réseaux d'alimentation en eau sans pour autant être associée à des cas connus de la maladie du légionnaire. En outre, le risque de contracter la maladie dépend de nombreux facteurs autres que l'exposition, y compris la susceptibilité de l'hôte, la virulence de la souche et l'efficacité de la pulvérisation.

Toutefois, l'analyse peut être utile lorsqu'elle vise un but précis, par exemple, pour vérifier l'efficacité d'une méthode de traitement de l'eau ou retracer la source d'une éclosion.

Culture bactérienne pour détecter la Legionella (par écouvillon ou par échantillon d'eau en vrac)

La norme de référence en matière de détection de la Legionella est l'analyse par culture effectuée en conformité avec norme ISO/TS 11731:2004 : Qualité de l'eau – Recherche et dénombrement des Legionella – Partie 2 : Méthode par filtration directe sur membrane pour les eaux à faible teneur en bactéries. Cette forme d'analyse est largement reconnue comme étant la méthode la plus fiable pour détecter la bactérie Legionella, y compris la souche qui cause la maladie du légionnaire. Elle est également approuvée par le Centre for Disease Control des États-Unis.

Toutefois, cette méthode comporte des inconvénients; l'inconvénient principal est que les espèces de Legionella connaissent une croissance lente, ce qui fait que les résultats des cultures ne peuvent être disponibles qu'après une période d'attente de 7 à 14 jours. La croissance initiale peut être lente, et il faut habituellement au moins un repiquage, et donc une période d'incubation supplémentaire, pour déterminer le genre de la bactérie. La présence de contaminants naturels d'origine bactérienne ou fongique peut nécessiter un repiquage supplémentaire ou même masquer la présence de Legionella.

Des échantillons peuvent être prélevés au moyen d'un écouvillon ou à partir d'un échantillon d'environ 500 à 1 000 ml d'eau dans un contenant. Il faut consulter des laboratoires spécialisés avant de faire les prélèvements pour connaître les techniques d'échantillonnage à utiliser, la façon de manipuler et de transporter les échantillons, et le type de bouteilles d'échantillonnage à employer.

Les méthodes d'analyse par culture permettent de quantifier le nombre total de bactéries, de bactérie Legionella ainsi que des sérogroupes précis, notamment le sérogroupe 1 de Legionella pneumophila, l'organisme en cause dans de nombreuses éclosions.

Les résultats des essais sont généralement indiqués comme Legionella autre que Legionella pneumophila (LALP) et Sérogroupe 1 de Legionella pneumophila (LPSG1). L'unité de mesure pour ces deux essais est l'unité formatrice de colonie par millilitre (UFC/ml).

Analyse par lame gélosée

Cette méthode d'analyse est recommandée par le Health and Safety Executive (HSE) du Royaume-Uni. Pour les tours de refroidissement, le HSE recommande d'effectuer une culture sur lame gélosée de façon hebdomadaire, avec des limites d'action allant de 10 000 à 100 000 UFC/ml. Lorsque l'on atteint 10 000 UFC/ml, le HSE suggère de revoir les activités du programme. Lorsque l'on atteint la plus haute limite d'action, soit 100 000 UFC/ml, le HSE recommande des mesures correctives, comme le nettoyage et la décontamination.

L'analyse par lame gélosée est un test indirect de la présence de Legionella, puisqu'elle ne mesure que la numération bactérienne (NB). L'analyse permet simplement de constater que la numération bactérienne totale d'une source d'eau a atteint un niveau permettant de déterminer que les nutriments et la température pourraient favoriser la croissance de Legionella.

L'utilisation de lames gélosées du commerce rend cette méthode facile et relativement peu coûteuse. L'échantillonnage nécessite l'utilisation d'une trousse fournie par un fournisseur spécialisé et le prélèvement d'un échantillon d'eau en vrac appliqué sur un milieu. La numération bactérienne peut être constatée visuellement et les résultats sont généralement disponibles dans les 24 à 72 heures.

Les lames gélosées utilisées devraient être stérilisées avant d'être éliminées en les faisant tremper pendant au moins 60 minutes dans une solution d'eau de Javel concentrée à 5 %.

Essai de réaction en chaîne de la polymérase

Le test de réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est basé sur l'analyse de l'acide désoxyribonucléique (ADN) de la bactérie Legionella. Différents types de tests PCR peuvent produire des résultats qualitatifs et quantitatifs en une très courte période de temps.

Un très grand nombre d'analyses par PCR ont été élaborées pour la Legionella, en général, et pour cibler plus précisément L. pneumophila, y compris une norme ISO récente, la norme ISO/TS 12869:2012 – Qualité de l'eau – Détection et quantification de Legionella spp. et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne quantitative (qPCR). Ces tests présentent un avantage direct comparativement aux techniques de culture : elles peuvent produire des résultats en 1 ou 2 jours. Les tests PCR pour détecter la Legionella peuvent être classés en trois grandes catégories.

La première catégorie est celle de la PCR simple (aussi appelée PCR conventionnelle), qui permet de détecter la présence ou l'absence de l'ADN de Legionella et/ou de l'ADN de types particuliers de Legionella. Parmi les techniques de PCR simple, on trouve la PCR nichée, soit deux PCR successives dont la seconde utilise des amorces ciblées sur le produit de la première pour cibler des marqueurs d'ADN précis, ou une PCR multiplex qui vise l'amplification de plusieurs cibles simultanément.

La deuxième catégorie est la PCR quantitative (qPCR) qui peut fournir des renseignements sur la quantité d'ADN de Legionella présent ainsi que sur les quantités d'ADN d'espèces individuelles ou d'autres sous-types (p. ex. L. pneumophila dans l'ensemble ou le sérogroupe 1 de L. pneumophila). Les modifications apportées à la qPCR standard, comme l'inclusion de sondes d'hydrolyse, peuvent faire augmenter de façon significative la spécificité analytique de la procédure. Des renseignements quantitatifs sur le gène cible peuvent ensuite être utilisés pour prédire la quantité de Legionella dans l'échantillon en équivalents génomiques par ml (GE/mL), une approximation de la population cellulaire totale de Legionella.

La troisième catégorie est celle de la PCR viable (v-PCR), où des agents destructeurs de l'ADN, comme l'azide d'éthidium ou de propidium, peuvent être utilisés des échantillons prétraités pour éliminer l'ADN qui n'est pas protégé à l'intérieur des cellules vivantes. Ces techniques de prétraitement peuvent ensuite être combinées à une PCR simple ou à une qPCR pour confirmer la présence d'ADN associé à l'inoculum vivant de Legionella ou à en estimer la quantité.

Toutefois, le fait que le test PCR simple peut détecter l'ADN résiduel de cellules mortes comporte des avantages comme des désavantages. Dans certains cas, ce peut être un avantage, comme lorsqu'un grand inoculum vivant de Legionella a été détruit par des désinfectants dans l'eau transportée au laboratoire ou par une application de biocides avant que l'on ait retracé la source d'une éclosion. Dans d'autres cas, ce peut être un désavantage, comme lorsqu'une quantité de cellules mortes cliniquement négligeable peut donner le même résultat (présence plutôt qu'absence) qu'un grand inoculum d'organismes vivants dangereux.

Comparaison de l'analyse par culture bactérienne avec l'essai de réaction en chaîne de polymérase

Un sommaire de la comparaison entre l'analyse par culture bactérienne et sa méthode d'analyse avec l'essai de PCR et sa méthode d'analyse est inscrit au tableau A1 ci-dessous.

Tableau A1 : Comparaison de méthodes d'analyse
Avantages des analyses par mise en culture Désavantages des analyses par mise en culture
  • Les résultats quantitatifs (UFC/ml) permettent l'interprétation des données relatives à la concentration de la source bactérienne.
  • Le sérotypage des bactéries permet la comparaison avec le sérotype des organismes trouvés chez les patients infectés.
  • L'injection de biocides dans la source d'eau peut empêcher la détection.
  • L'analyse prend de 7 à 10 jours.
  • Il faut ajouter du thiosulfate ou du métabisulfite aux échantillons d'eau pour empêcher le chlore de tuer les bactéries pendant le transport.
Avantages des tests de la chaîne de polymérase Désavantages des tests de la chaîne de polymérase
  • Les résultats de l'analyse peuvent être obtenus en 1 à 2 jours.
  • La méthode qPCR peut produire des résultats quantitatifs (équivalents génomiques/ml).
  • Le traitement de l'eau aux biocides avant l'échantillonnage n'empêche pas la détection de la Legionella.
  • Les coûts sont comparables à ceux de l'analyse par culture bactérienne.
  • L'identification de l'espèce est possible, mais le sérotypage des organismes ne l'est pas.

À noter : la détection du sérogroupe 1 de L. pneumophila, le sérogroupe le plus important dans le domaine médical, n'est plus limitée grâce à l'élaboration d'une procédure de détection précise.

Référence : Sporometrics

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